自体细胞体外培养技术

干细胞移植已经开展了几十年，最初是骨髓移植，随后出现干细胞移植。医生从病人或捐献者的骨髓或血液中搜集干细胞，然后注入病人，治疗白血病、淋巴瘤和其它血液病。随着生物技术的飞速发展，治疗疾病的方法也越来越多，所需求的水平也越来越高，包括自体干细胞移植。干细胞最大的特征是它们没有其他组织细胞，造血干细胞移植是取患者自身骨髓、异体骨髓或脐血转输给患者，适用于多发性恶性淋巴瘤、低危的急性白血病等疾病，可让患者生存率大大提高，干细胞移植是现在细胞治疗疾病的一个很重要的手段，而且非常成熟了。

自体干细胞移植主要分为两步，即自体干细胞的采集和干细胞的移植。

在临床上根据自体干细胞采集的方法不同分为骨髓干细胞移植和外周血干细胞移植。前者先在无菌条件下采集患者自体骨髓50～100ml，通过分离、纯化等过程，制成含有足够数量干细胞的细胞悬液;后者是给患者注射4-5天粒系集落刺激因子，以动员骨髓干细胞进入外周血，使其在外周血中达到一定数量，再用血细胞分离机分离出需要的干细胞进行移植。

这几年来，对干细胞的研究成为了我公司研究的重点。已经成为治愈多种良性还有恶性血液病与遗传性疾病非常重要的手段。首先，确认病人的外周血中没有引起疾病复发的细胞如白血病细胞、骨髓瘤细胞、淋巴瘤细胞等。

（一）移植流程：

1、采血：需要采集客户约150ml-200ml外周血。

2、生产：采集好的外周血经离心后收集有核细胞，用造血干细胞专用培养基培养，使有核细胞逆转成为造血干细胞。

3、检测：采集的外周血，干细胞生产的第3天和第6天均做细菌检测、细胞计数和流式细胞，确保干细胞生产过程中不被污染，且干细胞数量稳定增长。

4、储存：收集生产到第六天的干细胞，分装到2ml的冻存管中，程序性降温到零下80℃后，按照储存要求存放到零下196℃的液氮罐中，可永久保存。

目前临床已积累了丰富的抽取干细胞的经验；在分离纯化过程中，将在完善的洁净环境中进行，并严格实行无菌操作；各种试剂都经过严格无病原试验并不含任何动物成分；干细胞在输注之前将被彻底清洗，进一步排除任何病原及试剂进入体内的可能。胰腺插管由经培训的导管专家实施，尽量减少了因导管引起的并发症。

在大量动物实验中，自体干细胞移植后未发现胰腺炎、肝功能损害等引起的动物死亡，未发现移植后肿瘤形成。在已实施病例中，无严重全身或胰腺感染，无肝肾功能损害，无心脑血管并发症，未发生导管相关的并发症如大量出血、导管折断等。自体骨髓干细胞移植治疗糖尿病的安全性已得到临床证实。

（二）细胞培养的条件和基本要求    

1、所有与细胞接触的设备、器材和溶液等，都必须保持绝对无菌，避免细胞外微生物的污染。

2、目前最可靠和最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌。

如：玻璃制品、布类、金属制品：6.8kg20min。

橡胶制品：3.6～4.5kg10min。

培养用液，如Hanks液，水解乳蛋白：3.6～ 4.5kg10min。实验中染菌物品和动物尸体等：6.8 kg20min。

试管、吸管等，则可采用干热灭菌；

一切不适于加热灭菌的液体，如人工合成培养液、小牛血清、胰蛋白酶等溶液，可采用过滤法除菌。细胞培养中常用的消毒剂浓度及其使用场合。

2、必须有足够的营养供应，而绝对不可有有害的物质，包括极微量的有害离子的掺入，为此必须注意器材的清洗和配液用水的质量。 

细胞培养中对水的质量要求很高（见水处理）

3、保证有适量的氧气供应

细胞代谢需要有空气，否则细胞死亡。在用培养瓶进行静止培养，或用转瓶进行旋转培养时，只要培养的液体量不超过总容量的30％，通过与液面的空气交换，可以保证细胞有足够的氧气。当用罐子深层培养时，则必须通气，一般采用含5％CO2的空气，或根据需要将CO2、N2、O2和空气以不同比例混合，过量氧对细胞的生长也不利。

4.需随时清除细胞代谢中产生的有害产物。 

细胞在代谢过程中会产生大量代谢废物，如CO2、乳酸、氨、尿素、吲哚等，这些产物对细胞的生存有害，必须及时清除。在小量培养时，当培养基中酚红指示剂显示黄色，表示已有相当量乳酸产生，要及时更换新鲜的培养基。在大量培养时，则需随时测定葡萄糖和乳酸等含量，并调节灌流速度，使代谢产物保持在无害水平下。

5.有良好的适于其生存的外界环境，包括温度、pH、渗透压和离子浓度等。 

不同的细胞对pH的要求不同，一般来说适于细胞生长的pH在6.8～7.4，过高或过低均不利于细胞生长。如上所述，细胞在代谢过程中会产生大量乳酸，使培养的pH下降。为了保持培养液的pH，常在培养液内加入各种缓冲系统，如Na2HPO4/Na2HPO4、NaHCO3/H2CO3（CO2）、Tricineglycine，以及加缓冲剂Hepes液（常用浓度为10～50mol/L）。

6、及时分种，保持合适的细胞密度。

（三）细胞分离：

1、人白细胞的分离：常用于IFN－α和γ的制备。它主要来源于患者的静脉血，分娩时脐带血，以及脾脏和扁桃体等组织。

2.人胚肌皮细胞的分离 。用于IFN-β的制备 。

（四）体外培养细胞龄的计算

二倍体细胞龄以细胞群体倍增计算，以每个培养容器细胞群体细胞数为基础，每增加一倍作为一世代，即1瓶细胞传2瓶（1：2分种率）再长满瓶为一世代；1瓶传4瓶（1：4）为二世代；1瓶传8瓶（1：8）则为三世代。生产用细胞龄限制在细胞寿命期限的前2/3内。

传代细胞系则以一定稀释倍数进行传代，每传一次为一代。依据每个细胞系的实践经验数据，确保细胞质量及安全，确定生产使用细胞最后限制代次。

（五）以下情况不能进行细胞移植：

1.恶性肿瘤；2.严重心脏病：急性心肌梗塞、失代偿性心力衰竭、严重心律失常、不稳定型心绞痛等；3.任何原因的肝功异常；4.急性或慢性肾衰；5.严重哮喘或其它严重呼吸功能不全；6.出血性疾病或凝血异常；7.先天性或获得性的免疫缺陷性疾病；8.造影剂过敏；9.任何急性或慢性感染；10.以前进行过任何形式的心血管介入手术；11.胸或腹主动脉疾病；12.既往颈动脉疾病病史；13.正在应用抗凝药物。